盆腔器官脱垂是一种严重影响生活质量的慢性病症，其发生与妊娠及衰老密切相关。为盆腔器官提供顶端支撑的子宫骶韧带（USL）损伤，是导致子宫脱垂的主要原因。本研究探讨了妊娠与年龄对小鼠子宫骶韧带表观弹性模量、胶原损伤易感性及细胞外基质（ECM）组成的影响。研究选取三个不同妊娠阶段及两个年龄组小鼠的子宫骶韧带，进行力学性能测试与胶原微损伤评估，并采用拉曼光谱分析细胞外基质组成变化。结果表明：（1）所有受机械牵拉的子宫骶韧带均出现胶原微损伤；（2）妊娠与年龄均显著影响韧带硬度及损伤易感性；（3）妊娠可改变细胞外基质组成，而年龄对此无明显影响。总体而言，本研究在揭示组织微结构与力学功能在子宫骶韧带损伤中的作用方面取得重要进展，可为子宫脱垂的新型细胞外基质靶向治疗与预防策略提供理论依据。
一、引言全球范围内，约 50% 的 50 岁以上女性受盆腔器官脱垂（POP）困扰，该病以盆腔器官（膀胱、子宫、宫颈及直肠）从正常解剖位置下移为特征。盆腔器官脱垂患者常需接受手术修复以改善生活质量。除疼痛、大小便失禁及性功能障碍等生理症状外，患者还常伴随自我形象降低、焦虑与抑郁等心理问题。美国女性一生中因盆腔器官脱垂接受盆底重建手术的风险为 13%，以缓解相关症状。
目前认为，盆腔器官脱垂源于盆底支持结构功能减弱，包括为盆底器官提供主动支撑的盆底肌群功能下降，以及负责阴道与盆腔器官顶端力学支撑的子宫骶韧带（USL）功能失效（图 1A.、图 1B.）。子宫骶韧带功能减退会导致盆腔器官顶端支撑丧失，并与重度盆腔器官脱垂密切相关。盆底手术中实现阴道顶端的持久支撑对预防脱垂复发至关重要；然而，在接受子宫切除术的脱垂患者中，采用子宫骶韧带悬吊阴道的术后 5 年失败率约为 60%。因此，盆腔器官脱垂不仅涉及神经肌肉损伤与解剖结构功能异常，还包括再生能力有限的结缔组织（即子宫骶韧带）结构破坏。
图1. 在人体（A）和小鼠（B）解剖结构中，子宫骶韧带（USL）均连接宫颈与骶骨。本研究对小鼠子宫骶韧带的中段区域（C）进行了检测分析。
年龄、体重、产次、分娩方式（顺产或剖宫产）以及遗传等易感因素，均被认为会影响包括子宫骶韧带（USL）在内的盆底组织力学完整性。而妊娠与分娩、年龄增长及绝经，则被视作盆腔器官脱垂（POP）的主要诱因。
妊娠与分娩均可能增加子宫骶韧带（USL）所受的机械应力与应变，引发结构损伤，进而提高女性发生盆腔器官脱垂（POP）的风险。不过，妊娠相关的机体变化理应能让子宫骶韧带（USL）耐受较大应变而避免损伤，已有研究证实，即使是较低的应变水平也会导致大鼠内侧副韧带出现损伤。年龄是影响盆底解剖结构与功能的另一重要因素，但其在盆腔器官脱垂（POP）发病机制中的作用尚不明确。可能是衰老相关的改变使子宫骶韧带（USL）更易发生力学损伤。然而，子宫骶韧带（USL）的力学性能（包括损伤易感性）如何随妊娠与年龄发生变化，目前仍未被探究。
子宫骶韧带（USL）的力学完整性来源于其细胞外基质（ECM），包括胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖（GAGs）。根据沿韧带长度的成分梯度差异，子宫骶韧带（USL）通常可分为三个独立区域：宫颈段、中段与骶骨段。宫颈段富含平滑肌细胞，而骶骨端的胶原蛋白含量更高（图 1C.）。I 型胶原纤维是结缔组织主要的抗拉承载组分，因此其很可能参与子宫骶韧带（USL）的损伤与断裂过程，进而与盆腔器官脱垂（POP）相关。同理，弹性蛋白受损会导致组织伸长，影响子宫骶韧带（USL）的结构完整性。糖胺聚糖（GAGs）参与结缔组织修复过程，其含量下降会阻碍子宫骶韧带（USL）损伤后的恢复。
目前对于妊娠期间及产后子宫骶韧带（USL）的成分与力学性能如何变化仍知之甚少，但相关组织的研究已观察到，妊娠会对子宫、宫颈及阴道的细胞外基质（ECM）与力学行为产生影响。妊娠期人体子宫的胶原蛋白与弹性蛋白含量均显著升高，而宫颈组织中糖胺聚糖（GAGs）含量在妊娠晚期上升，并在产后迅速下降。与此同时，小鼠与大鼠宫颈的硬度在妊娠期降低，分娩后开始恢复至孕前水平。由于子宫骶韧带（USL）直接延续自宫颈，二者成分相近。因此我们假设，妊娠期子宫骶韧带（USL）会出现类似的硬度下降，同时胶原蛋白、弹性蛋白与糖胺聚糖（GAGs）含量上升。
同样，年龄对妊娠前后子宫骶韧带（USL）力学特性与成分的影响也尚未明确，但相关组织研究已观察到衰老对力学性能的作用。胶原纤维束与肌腱等结缔组织的硬度从青春期至成年期逐渐升高，并在雌激素分泌停止后下降。针对绝经前与绝经后女性阴道组织力学性能的对比研究表明，绝经后阴道组织硬度显著更高。据此我们假设，子宫骶韧带（USL）的硬度随年龄增长而升高。
本研究采用小鼠模型，探究妊娠与年龄对子宫骶韧带（USL）中段表观弹性模量、胶原损伤易感性及细胞外基质（ECM）成分（具体为胶原蛋白、糖胺聚糖与弹性蛋白含量）的影响。我们假设，妊娠诱导的细胞外基质（ECM）重塑，可使妊娠晚期与产后早期小鼠的子宫骶韧带（USL）相较于未孕小鼠更能耐受应变诱导的胶原损伤，且组织更柔顺。我们进一步假设，机体发育至成年过程中的细胞外基质（ECM）变化，会使子宫骶韧带（USL）硬度升高，同时降低其对应变诱导胶原损伤的耐受能力。
二、方法2.1. 样品制备
雌性野生型 C57BL/6J 小鼠购自杰克逊实验室，相关实验经科罗拉多大学博尔德分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。将雌鼠与雄性野生型 C57BL/6J 小鼠进行定时交配，发现交配栓当日中午记为胚胎期 E0.5。采用二氧化碳吸入法实施安乐死，并通过脱颈椎法确认。若存在幼崽，予以断头处理。选用青年成年鼠（YA，10–15 周）与成年鼠（A，17–26 周）雌性小鼠，用于研究年龄对子宫骶韧带（USL）成分及力学功能的影响。为探究妊娠与分娩的作用，在三个不同妊娠阶段采集子宫骶韧带（USL）样本：未孕组（NP）、妊娠第 18.5 天晚期妊娠组（E18）、产后第 1 天组（PP1）。各实验组小鼠数量为：青年成年晚期妊娠组、成年晚期妊娠组 n=5 (YA E18, A E18)；青年成年未孕组、青年成年产后组、成年未孕组、成年产后组 n=6(YA NP, YA PP1, A NP, A PP1)。
参照研究人员建立的方案，分离每只小鼠的双侧子宫骶韧带（USL），并在宫颈端缝合结扎。一侧新鲜取材的子宫骶韧带（USL）用于力学测试，保留其与骨盆及部分宫颈组织的连接以固定试样，随后进行力学检测。对侧子宫骶韧带（USL）置于离心管中，经液氮快速冷冻后，于 - 80℃条件下保存，直至采用拉曼光谱法检测细胞外基质（ECM）成分。
2.2. 力学测试与成像
用于力学测试的子宫骶韧带（USL）样本置于 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入比例为 1:500 的 Ghost Dye Red 780 染料对所有游离胺基进行染色，在 4℃、200rpm 摇床条件下孵育 2 小时。在最后 15 分钟，向溶液中加入浓度为 1:1000 的死细胞核染料 Sytox Deep Red。
先测量韧带中段的横截面积与子宫骶韧带（USL）长度，随后将样品置于定制加载腔中，该装置安装在正置共聚焦显微镜下，腔内盛放 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。采用定制 3D 打印夹具，将骨盆端固定在加载腔一端，带有缝合线的宫颈端系于浮力系统上，该系统基于既往研究方案改进。浮力系统连接线性驱动器与 100mN 载荷传感器（图 2A.）。对每一个子宫骶韧带（USL）样品，以约 500μN 预载定义参考状态，并记录预载时驱动器位置，以便在测试过程中将样品恢复至参考状态。
图2. 对子宫骶韧带（USL）样本进行力学测试，并使用胶原杂交肽（CHP）原位染色，以探究组织形变与胶原损伤之间的关系。（A）力学测试装置包含定制加载腔，可在1×磷酸盐缓冲液（PBS）环境中对小鼠宫颈-子宫骶韧带-骨盆样本进行测试。（B）实验流程包括力学测试、胶原杂交肽（CHP）原位染色和共聚焦成像的重复循环。（C）位移追踪通过对比参考状态与形变状态下Ghost Dye和Sytox的合成图像，估算位移与应变场。图中为青年成年未孕（YA NP）样本在2000 μm位移加载下的参考状态与形变状态。将参考图像与对应形变图像（经估算位移场校正后）进行比对，以验证位移追踪精度。（D）损伤图谱基于胶原杂交肽（CHP）图像，采用移动阈值法计算生成。比例尺=500 μm。
力学测试前，排空 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），更换为 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）配制的 10μM 胶原杂交肽（CHP）溶液。胶原杂交肽（CHP）是一种可特异性结合变性（损伤）胶原分子的分子探针。样品在原位染色 15 分钟。基线染色完成后，移除胶原杂交肽（CHP）溶液，更换新鲜 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），该染色流程参照已有方法进行。每次形变后重复上述染色步骤，以评估胶原损伤变化。胶原杂交肽（CHP）染色期间断开浮力系统，避免更换液体时牵拉样品，随后重新连接，在参考状态下重复成像。
使用 10 倍水浸物镜在 1 倍放大倍率下对子宫骶韧带（USL）成像。设置增益与激光强度，使 Ghost Dye 与 Sytox 通道的像素强度覆盖完整范围（0–255）。对胶原杂交肽（CHP）通道调节增益，使初始强度范围处于 0–100，以保证信号可检测，同时能够记录每次形变后胶原损伤增加带来的信号升高。
形变状态通过驱动器以 50 μm/s 的速度分别施加 1000、1500 和 2000 μm 的固定位移实现，随后进入 5 分钟的应力松弛阶段。记录松弛后的载荷，并以载荷除以横截面积计算平均轴向应力。在每个参考状态与形变状态下均对样品表面进行成像。每次形变后将样品恢复至参考位置，使用胶原杂交肽（CHP）染色 15 分钟后再次成像（图 2B.）。
2.3. 形变与损伤图谱分析
鉴于各组间子宫骶韧带（USL）长度存在差异（见补充材料图 1A.），采用研究人员报道的全域分析方法估算组织形变。简言之，对每个图像堆栈构建最大强度投影图，通过对比参考状态与形变状态下 Ghost Dye 和 Sytox 的合成图像获取二维位移场。首先在 MATLAB 中使用 cpselect 函数，在每组参考与形变图像上手动选取特征点（以细胞核为主）完成初始位移场估算，再通过二维线性插值得到感兴趣区域（ROI）内的位移矢量，随后使用 MATLAB 函数 imregdemons 对位移场进行精细优化。最终根据估算得到的二维位移场计算格林 - 拉格朗日应变场。
手动选取解剖学中点以确定子宫骶韧带（USL）中段，将其定义为每个样品中部长度为 1000 μm 的区域。基于中段感兴趣区域的应变场，计算平均轴向应变（E11）、横向应变（E22）与剪切应变（E12）（图 2C.）。在平面应变假设（E33=0）下，同时估算平均静水压应变（Ehyd）。对胶原杂交肽（CHP）投影图采用研究人员提出的动态阈值法构建胶原损伤二值图谱，判定存在显著胶原损伤的像素点。该阈值方法可有效避免多次染色导致的图像强度升高带来的干扰。基于上述胶原损伤图谱，计算中段区域内显著损伤面积占比（即损伤面积百分比）（图 2D.）。
2.4. 拉曼光谱检测
将速冻保存的对侧子宫骶韧带（USL）样品解冻，制备用于拉曼光谱检测的样本。使用昆虫针将宫颈缝合线与骨盆组织固定在定制孔槽内的聚二甲基硅氧烷（PDMS）块上，使子宫骶韧带（USL）在针之间呈直线伸展。采用正置 InVia 共聚焦显微镜开展拉曼光谱检测（图 3A.）。首先使用 5 倍放大物镜对样品成像，定位子宫骶韧带（USL），随后将样品置于 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中。沿子宫骶韧带（USL）采集网格图谱，光谱点间距设为 100μm×150–200μm，阵列规格为 3×12–15（图 3B.）。采用 785nm 红光激光器激发样品(Innovative Photonic Solutions) ，不加偏振滤光片，使用 63 倍浸液物镜收集拉曼光谱，激光光斑尺寸为 1.06μm。使用 1200 线 / 毫米光栅与电荷耦合器件（CCD）相机，在 725cm∧（-1）至 1814cm∧（-1）波长范围内实现约 1cm∧（-1）的光谱分辨率。系统采用内部及外部硅标准品进行校准。
图3. 采用拉曼光谱分析子宫骶韧带（USL）的成分变化。（A）将小鼠宫颈-子宫骶韧带-骨盆标本固定在聚二甲基硅氧烷（PDMS）块上并浸没于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，使用水下10倍物镜与共聚焦拉曼显微镜采集光谱。（B）沿子宫骶韧带（USL）进行光谱扫描，图中为代表性原始光谱。（C）采用基于伪信噪比（pSNR）的方法剔除低质量数据后，计算韧带中段区域的平均光谱。
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拉曼光谱按照研究人员描述的方法进行处理：识别并去除宇宙射线干扰，扣除线性基线，对每条光谱进行强度矢量归一化。将每个图谱均分为三段，近似确定子宫骶韧带（USL）的中段区域。
部分光谱存在明显的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底信号、感兴趣区内混入骶骨端或宫颈端信号，或是噪声过高。为保证信号质量且仅来源于子宫骶韧带（USL）中段，本研究基于伪信噪比（pSNR）制定了光谱筛选标准。伪信号由中段归一化光谱的平均值确定，伪噪声由单条光谱与平均光谱的差值确定。使用 MATLAB 中的 snr 函数估算每条光谱的伪信噪比（pSNR），剔除伪信噪比（pSNR）最低的光谱后重新计算平均伪信号，重复此过程直至所有入选光谱的伪信噪比（pSNR）≥10。最终得到每个样品的平均光谱，用于组间比较（图 3C.）。
首先采用主成分分析（PCA）评估妊娠与年龄对组织成分的影响。主成分分析可将具有相关性的变量（即波长）转化为互不相关的变量，即主成分（PCs）。第一主成分（PC1）代表最大累积方差，后续主成分则解释剩余的方差差异。为使主成分更具可解释性，研究人员从文献中获取了纯纤维胶原、弹性蛋白与糖胺聚糖（GAGs）的拉曼光谱并纳入分析，所有分析均使用 MATLAB 中的 pca 函数完成。
在 MATLAB 中采用多元曲线分辨（MCR）方法，更定量地评估胶原、弹性蛋白与糖胺聚糖（GAGs）的贡献。将每个样品的平均光谱分解为所研究纯组分光谱的线性组合：
式中 D 为样品光谱矩阵，C 为纯组分的相对浓度，S 代表胶原、弹性蛋白或糖胺聚糖（GAGs），E 为残差矩阵。
2.5. 统计分析
采用线性混合效应模型（LMM），从多个应变分量及轴向应力角度，探究妊娠与年龄对子宫骶韧带（USL）表观弹性模量（平均轴向应力 - 应变关系）和力学胶原损伤易感性（损伤面积百分比 - 应变关系）的影响。使用 MATLAB 中的 fitlme 函数进行拟合，以因变量（轴向应力或损伤百分比）为固定效应，纳入应变与妊娠阶段、应变与年龄的交互作用项，并以生物学重复为分组设置不相关随机效应，无截距项。同时拟合全部六个实验组的数据，以分析年龄与妊娠阶段的共同作用。对多元曲线分辨（MCR）系数进行双因素方差分析，判断妊娠与年龄是否显著改变子宫骶韧带（USL）成分。采用 Tukey 法进行事后检验，确定组间效应。以 p 值小于 0.05 为差异具有统计学意义。
三、结果研究发现，妊娠与年龄均显著影响子宫骶韧带（USL）的表观弹性模量和损伤易感性。线性混合效应模型（LMM）对损伤面积百分比与平均静水压应变的分析表明，未孕（NP）小鼠的子宫骶韧带（USL）比产后 1 天（PP1）小鼠更易发生机械应变相关的胶原损伤；即在相同静水压应变水平下，产后 1 天（PP1）小鼠的子宫骶韧带（USL）损伤程度显著更低（图 4A.）。这种损伤易感性的差异在平均轴向应变维度同样存在，如补充材料图 2A. 所示。相反，年龄增长会显著降低子宫骶韧带（USL）对静水压应变损伤的易感性(p < 0.05)，但不影响其对轴向应变的损伤易感性。各组在平均轴向应力、横向应变或剪切应变相关的损伤易感性上未观察到显著差异。
图4. 妊娠阶段与年龄均会影响小鼠子宫骶韧带（USL）的损伤易感性和表观弹性模量。实线（青年成年组）与虚线（成年组）代表线性混合效应模型拟合曲线，该模型同时拟合了各组5–6个生物学重复样本的全部数据点（即3次拉伸状态）。 （A）在相同静水压应变水平下，产后（PP1）小鼠的子宫骶韧带（USL）微损伤显著少于未孕（NP）小鼠；而青年成年（YA）小鼠的微损伤显著多于成年（A）小鼠。 （B）成年小鼠的子宫骶韧带（USL）硬度显著高于青年成年小鼠；未孕（NP）小鼠的韧带硬度则显著高于妊娠晚期（E18）及产后小鼠。
通过对平均轴向应力与平均轴向应变的线性混合效应模型（LMM）分析可知，未孕（NP）小鼠的子宫骶韧带（USL）硬度高于妊娠晚期（E18）和产后 1 天（PP1）小鼠(图4B.)，提示妊娠期子宫骶韧带（USL）顺应性升高。与之相对，子宫骶韧带（USL）的表观弹性模量随年龄增长显著上升。研究通过 p 值收敛检验评估样本量的影响并确保统计学意义（见补充材料图4.）。
拉曼光谱结果显示，妊娠可改变子宫骶韧带（USL）的成分，而年龄无显著影响（图 5.）。拉曼光谱主成分分析（PCA）显示，3 个主成分可解释 92.7% 的总方差（见补充材料图5.）。各样品主成分得分散点图未按年龄或妊娠阶段出现明显聚类（见补充材料图5.）。然而，多元曲线分辨（MCR）分析表明，妊娠显著改变了胶原含量(p < 0.05)，数据显示胶原含量随妊娠进程升高（图 5B.）。但事后检验未发现组间显著性差异 (p = 0.096 for NP vs. E18 and p = 0.064 NP vs. PP1)。弹性蛋白含量随妊娠进程降低（图 5C.），事后检验显示产后 1 天（PP1）小鼠的弹性蛋白含量显著低于未孕（NP）小鼠(p < 0.05)。妊娠晚期（E18）小鼠的弹性蛋白含量也倾向于低于未孕（NP）小鼠，但差异不显著(p = 0.068)。相反，糖胺聚糖（GAGs）含量在妊娠期显著升高；事后检验同样显示未孕（NP）与产后 1 天（PP1）组间存在显著差异，而未孕（NP）与妊娠晚期（E18）组间无显著差异（图 5D.）。
图5. 拉曼光谱结果表明，妊娠（而非年龄）会影响子宫骶韧带（USL）的细胞外基质（ECM）组成。 （A）各实验组的平均光谱存在细微差异。基于多元曲线分辨（MCR）分析（公式（1））， （B）胶原蛋白含量升高， （C）弹性蛋白含量降低， （D）糖胺聚糖（GAG）含量升高。 事后分析显示，青年成年（YA）组和成年（A）组中，未孕组（NP）与产后组（PP1）的子宫骶韧带（USL）在弹性蛋白和糖胺聚糖（GAG）含量上存在显著差异。
四、讨论本研究探究了妊娠与年龄对小鼠子宫骶韧带（USL）表观弹性模量、力学胶原损伤易感性及细胞外基质（ECM）组成的影响。研究采用全域分析方法绘制力学测试过程中子宫骶韧带（USL）的应变与胶原损伤分布图，并通过拉曼光谱检测对侧韧带的细胞外基质（ECM）组成。实验数据来源于六个不同组别，包括两个年龄组（青年成年组、成年组）和三个妊娠阶段组（未孕组、妊娠第 18 天组、产后第 1 天组）。结果表明，妊娠与年龄以不同方式影响子宫骶韧带（USL）的表观弹性模量与损伤易感性，而细胞外基质（ECM）组成仅受妊娠影响。
本研究发现妊娠期子宫骶韧带（USL）硬度降低，据此推测妊娠小鼠韧带的胶原含量更低或弹性蛋白含量更高。然而，拉曼光谱分析结果与预期相反：妊娠期弹性蛋白含量降低、胶原含量升高，尽管胶原组成的组间两两比较未达显著水平。该结果与既往针对宫颈的研究结果一致，相关研究报道妊娠期宫颈硬度下降，同时未成熟胶原交联增加、成熟胶原交联减少，总胶原含量无明显变化。另有研究发现，妊娠期子宫胶原含量升高。因此，后续研究应进一步探讨妊娠期子宫骶韧带（USL）胶原含量与胶原交联的变化规律。
与之相反，子宫骶韧带（USL）的表观弹性模量随年龄增长而升高。据此推测青年成年小鼠YA韧带的胶原含量更低、弹性蛋白含量可能更高。但拉曼光谱分析显示，各年龄组间胶原、弹性蛋白及糖胺聚糖（GAG）含量均无显著差异，这可能与样本量较小或拉曼光谱自身局限性有关。本研究力学测试结果与既往大鼠肌腱发育相关研究一致，相关研究表明肌腱硬度随发育成熟显著升高。但与大鼠阴道支持组织的相关研究结果不符，后者发现青年大鼠与中年或去卵巢大鼠相比，组织硬度更低。这一差异可能源于实验方法不同，例如既往研究纳入盆底肌而本研究未纳入。此外，胶原交联的改变（本研究未检测）也可能是力学性能变化的原因。综上，上述结果提示有必要深入研究整个生殖生命周期中年龄对盆底支持组织的改变作用。
本研究还发现，与未孕（NP）小鼠相比，产后 1 天（PP1）小鼠子宫骶韧带（USL）受静水压应变引发胶原损伤的易感性降低。结合拉曼光谱结果可以推测，妊娠期弹性蛋白含量下降与糖胺聚糖（GAG）含量上升，可能有助于保护子宫骶韧带（USL）在分娩过程中免受胶原损伤，或促进产后组织修复。这一结果与糖胺聚糖（GAG）在结缔组织修复中发挥作用的已有结论一致。胶原交联状态的改变也可能参与其中，后续研究需进一步阐明妊娠期子宫骶韧带（USL）的胶原交联如何发生改变，从而降低其力学损伤易感性。
尽管妊娠晚期（E18）小鼠的子宫骶韧带（USL）弹性模量显著低于未孕（NP）小鼠，但两组在损伤易感性和细胞外基质（ECM）组成上无显著差异。同样，妊娠晚期（E18）与产后 1 天（PP1）小鼠之间也未发现明显差异。若扩大样本量，妊娠晚期组与其他组之间可能会显现更多差异，与已有文献报道趋势一致。例如，研究人员观察到小鼠在妊娠第 17 天时整个生殖道解剖结构已出现显著变化，另有研究显示大鼠宫颈在妊娠第 21 天可发生明显载荷松弛，但在产后 1 天基本完全恢复。
与本研究假设相反，子宫骶韧带（USL）的损伤易感性随年龄增长显著降低，尽管这一差异仅体现在静水压应变对应的损伤面积百分比上。我们认为原因可能在于本研究所选成年组年龄尚不算老龄，实验中最大周龄小鼠仅 26 周，而雌性小鼠的生育能力接近 1 周岁才开始下降。因此，本结果可能反映的是成年早期细胞外基质（ECM）的正常成熟过程。
最后值得注意的是，本研究测得的平均轴向应力（在相近应变水平下）比近期针对大鼠子宫骶韧带（USL）的研究结果高出一个数量级。我们认为这可能源于样本几何形态的差异，尤其是胶原纤维的分散程度。研究人员证实，胶原纤维分散（即胶原纤维在与其他组织附着处向外 “散开” 的现象）会混淆材料特性与几何特性，使韧带表现出比真实材料响应更柔顺的力学行为。在相关文献中，大鼠子宫骶韧带（USL）样本呈现明显的纤维分散，而本研究所用小鼠样本的长径比更大（约 1:6），纤维分散程度较低。因此我们认为，与已有报道相比，本研究的测量结果受纤维几何分散影响更小，更能代表子宫骶韧带（USL）真实的材料硬度，而既往研究可能低估了韧带组织的真实轴向硬度。
4.1. 广泛意义
本研究首次评估了妊娠、分娩与年龄对子宫骶韧带（USL）力学损伤易感性的影响，揭示了该韧带对机械牵拉所致微损伤的敏感性。明确子宫骶韧带（USL）最易发生力学微损伤的条件至关重要，这类微损伤可能导致韧带功能失效，进而引发盆腔器官脱垂（POP）。尤为关键的是，阐明细胞外基质（ECM）组成差异如何增加或降低韧带损伤风险，可为盆腔器官脱垂（POP）的预防策略提供依据，同时助力开发以细胞外基质（ECM）为核心、恢复子宫骶韧带（USL）功能的新型治疗方案。此外，本研究技术可应用于宫颈、阴道、子宫等其他易受力学损伤的相似组织，为探究妊娠及分娩相关组织损伤提供新思路。
从更广泛的角度来看，本研究发现以静水压应变关联微损伤，比采用加载方向的轴向应变更能清晰区分各组间损伤易感性的差异。这一结论与团队此前在小鼠内侧副韧带中的研究结果一致，即静水压应变是预测力学诱导胶原变性的最佳单一指标。综合表明，静水压应变在软组织结缔组织微损伤累积过程中发挥重要作用。
4.2. 局限性与未来研究方向
尽管本研究结果表明年龄和妊娠均会影响子宫骶韧带（USL）的力学特性，且妊娠会改变细胞外基质（ECM）组成，但仍需客观认识本研究存在的局限性。样本量有限导致数据存在一定变异性。此外，本研究未对发情周期进行控制，这可能增加了未孕（NP）小鼠子宫骶韧带（USL）力学与生化数据的离散程度；已有研究指出，发情周期会影响子宫硬度。同样值得注意的是，子宫骶韧带（USL）的长度与横截面积存在个体差异（见补充材料图 1A.、图 1B.）。未孕（NP）小鼠的韧带通常短于妊娠晚期（E18）和产后 1 天（PP1）小鼠，青年成年小鼠的韧带显著短于成年小鼠。本研究采用光学方法直接测量组织应变，以最大程度降低样本几何形态对力学检测结果的影响。虽然横截面积存在差异，但各组间无明显区别。子宫骶韧带（USL）尺寸差异可能与妊娠及年龄增长带来的小鼠体重 (p < 0.05)显著增加有关（见补充材料图 1C.）。
力学数据的变异性，部分可能源于各组间韧带无载荷状态与体内牵拉状态关系的差异，而这一因素在本研究中未被纳入考量。如果力学测试从子宫骶韧带（USL）的体内生理长度而非参考状态（近似无载荷）开始，结果可能会有所不同。此外，粘弹性差异也可能造成数据波动，本研究未对此进行探讨。未来研究将重点量化妊娠与年龄引起的粘弹性变化。
本研究的一个主要局限在于拉曼光谱的半定量特性。该方法无法从成分层面解释年龄相关的子宫骶韧带（USL）硬度改变。年龄增长带来的硬度上升，很可能与胶原交联密度升高有关。但本研究所用设备未配备偏振器，因此无法对胶原交联进行定量分析。未来研究应采用更灵敏的定量方法，如质谱技术或生化检测，来分析目标细胞外基质（ECM）成分的具体作用。
此外，子宫骶韧带（USL）是一类具有三个独立分段的复杂组织（图 1.）。未来研究应进一步探讨妊娠与年龄对这三个分段力学行为及成分的影响。骶骨段与宫颈段的力学特性和成分，很可能与本研究检测的中段存在差异。
最后，本研究仅探讨了健康小鼠体内妊娠相关的组织变化。为明确妊娠期子宫骶韧带（USL）的力学功能、损伤易感性与微结构如何发生异常改变，后续将对高龄（>12个月）、肥胖等具有盆腔器官脱垂（POP）高危因素的小鼠子宫骶韧带（USL）进行研究。
五、结论衰老与妊娠是盆腔器官脱垂（POP）发生的关键危险因素股票怎么配资，而子宫骶韧带（USL）是核心盆底支持结构。明确上述因素如何影响子宫骶韧带（USL）的力学完整性与组织成分，对制定韧带损伤预防方案与盆腔器官脱垂（POP）手术治疗策略至关重要。本研究结果表明，健康妊娠期子宫骶韧带（USL）顺应性显著升高、损伤易感性降低，这一变化可能由弹性蛋白含量下降与糖胺聚糖（GAG）含量上升介导。与之相反，子宫骶韧带（USL）硬度随年龄增长显著升高，但其成分层面的改变机制尚不明确。尽管如此，本研究结果初步揭示了妊娠与年龄对子宫骶韧带（USL）力学功能及成分的调控作用。通过后续深入研究，本成果可为预防子宫骶韧带（USL）损伤进而避免盆腔器官脱垂（POP）提供指导，同时为以细胞外基质（ECM）为靶点、恢复韧带功能的脱垂治疗策略提供理论依据。
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